De hoofdrollen in CSI: NY zijn weggelegd voor detective Mack 'Mac' Taylor, gespeeld door Gary Sinise (bekend van bioscoophits als Forrest Gump, The Truman Show en Apollo 13), een toegewijde en gedreven crime-scene investigator, en zijn partner Stella Bonasera, gespeeld door Melina Kanakaredes (bekend van tv-series als Providence en NYPD Blue), een workaholic en een alleskunner. Zij staan aan het hoofd van een team van forensisch experts verbonden aan het politicorps van New York.